本发明涉及吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的新用途，具体涉及吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物在制备抗肺纤维化药物中的应用。
背景技术：
肺纤维化(pulmonaryfibrosis，pf)是多种病因各异的肺间质疾病的终末期临床表现，其病变特点是肺部炎症导致肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)的过度沉积，涉及到细胞因子ecm等因素间的相互作用，是多因素多环节参与的缓慢的错综复杂的过程。近年来其发病率呈不断上升趋势，临床表现为进行性呼吸困难并伴有刺激性干咳，肺功能为限制性通气障碍，可导致缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。目前，临床上肺纤维化尚无有效的治疗方法。
专利cn108558876a公开了“吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物及其制备方法和应用”，
所述化合物的结构如式i所示。
其中，r1选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环、取代或未取代的芳烃、取代或未取代的芳杂环；c1-c6脂肪链是指1-6个碳原子组成脂肪烃，c3-c6脂肪环是指3-6个碳原子组成脂肪环烃；
r2、r3分别独立地选自甲基、三氟甲基、取代或未取代的芳基；
r4选自-cn、-ch2nh2，-cooh、coor5、-ch2-nr6r7，其中，r5选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环、取代或未取代的芳烃、取代或未取代的芳杂环；r6、r7分别独立地选自-ch3、-c2h5；或者-nr6r7为取代或未取代的脂肪杂环。
专利cn108558876a公开了该类化合物具有抗肿瘤活性，可应用在抗肿瘤药物的制备中，目前，尚未见文献报道该化合物具有抗肺纤维化的功效及其在治疗肺纤维化疾病药物中的应用。
技术实现要素：
本发明提供了吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的新用途，即吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物在制备抗肺纤维化的药物中的应用，所述吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的结构通式如式(i)所示：
其中，r1选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环、取代或未取代的芳烃、取代或未取代的芳杂环；c1-c6脂肪链是指1-6个碳原子组成脂肪烃，c3-c6脂肪环是指3-6个碳原子组成脂肪环烃；
r2、r3分别独立地选自甲基、三氟甲基、取代或未取代的芳基；
r4选自-cn、-ch2nh2，-cooh、coor5、-ch2-nr6r7，其中，r5选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环、取代或未取代的芳烃、取代或未取代的芳杂环；r6、r7分别独立地选自-ch3、-c2h5；或者-nr6r7为取代或未取代的脂肪杂环。
进一步的，r1选自取代或未取代的芳杂环，取代的芳杂环结构中的取代基选自羟基、氨基和/或卤素；
r2选自取代或未取代的芳基，取代的芳基结构中的取代基选自羟基、氨基和/或卤素；
r3选自甲基、三氟甲基；r4为-ch2nh2。
进一步的，所述吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的结构式如式(ii)，简称jxd。
进一步的，所述肺纤维化为博来霉素诱导的肺纤维化。
提供一种药物组合物，其特征在于：包含所述的吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物或药学上可接受的盐、水合物或它们的组合，以及药学上可接受的辅料。
进一步的，所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。
在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型上，通过口服灌胃给药不同剂量的jxd试验研究发现，jxd可以显著降低博来霉素致小鼠肺组织纤维化的程度，缓解小鼠肺泡的病理改变，明显提高肺纤维化小鼠肺功能，下调促纤维化因子tgf-β1和fgf9含量。结果表明该化合物可明显改善肺纤维化模型小鼠的肺组织病理损伤，通过抗炎、抗纤维化作用发挥其抗肺纤维化的作用。
本发明提供了一种吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的新用途，即吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物在制备抗肺纤维化的药物中的应用，本发明中吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物对博莱霉素诱导的肺纤维化具有明显的预防治疗作用，吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物可用于制备防治肺纤维化的药物。
附图说明
图1：jxd对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织病理形态学的影响(he染色，200×)。
图2：jxd对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织病理形态学的影响(masson染色，200×)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施案例对本发明做进一步详细的说明。但本发明的保护范围不受具体实施案例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
实施例：在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型上，jxd对肺纤维化治疗作用的实验研究
1、实验方法
1.1分组、造模与给药
balb/c小鼠56只，雌雄各半，体重18.5～21.9g，按体重随机分为7组，分别为空白对照组、模型对照组、吡非尼酮组(250mg/kg)、jxd低、中、高剂量组(6.25、12.5、25mg/kg)，每组8只。除空白对照组外，其余各组动物按20ml/kg尾静脉注射剂量为150mg/kg博来霉素复制小鼠肺纤维化模型，空白对照组动物尾静脉注射等体积生理盐水，连续观察14天，期间每周称重一次。造模14天后，各组小鼠按照20ml/kg灌胃给予相应药液，空白对照组、模型对照组灌胃给予相应体积纯水，1次/日，连续14天。
1.2观察指标及检测方法
1.2.1小鼠一般生理状态及体重变化
给药期间，每日观察各组小鼠的精神状态、反应、活动度、毛发光泽，并与每日同一时间称取小鼠体重，观察其体重变化。
1.2.2肺呼吸功能和肺顺应性指标检测
给药结束后次日，各组动物按10ml/kg腹腔注射10％水合氯醛麻醉，暴露气管，采用小动物肺功能测定仪测定各组动物fvc、fev0.1、ri、cdyn，计算fev0.1/fvc。
1.2.3肺组织病理学观察
1.2.3.1肺组织大体标本观察
观察肺脏表面色泽、有无充血、苍白、出血点及结节等，手感质地、弹性等情况。
1.2.3.2小鼠肺脏病理切片观察
将左肺完全浸泡于10％福尔马尔溶液中，固定24h后，采用常规石蜡包埋，用石蜡切片机做连续切片，厚度约为5μm，备做he染色和masson染色，于200倍光学显微镜下观察肺组织进行组织病理学观察，主要观察肺组织的损伤及肺纤维增生情况。采用szapiel法对肺泡炎程度进行评价，0分：镜检肺泡形态无异常；1分：肺泡验证为轻度，有少许验证细胞浸润；2分：中等程度肺泡验证；3分：肺泡验证为重度，呈弥漫性分布。masson染色对肺纤维化程度进行评分，0分：肺组织正常，无胶原纤维增生；1分：少量胶原纤维；2分：胶原纤维较多，肺泡塌陷，肺泡结构紊乱；3分：大量胶原纤维，肺泡塌陷融合，肺泡结构明显破坏。
1.2.4酶联免疫法(elisa)检测肺纤维化相关指标
从右侧肺脏取下一叶肺叶，称重，按1:9比例加入预冷的生理盐水，冰上匀浆，匀浆完成后，3000r/min离心15min，取上清液待测。采用elisa法检测各组动物肺组织匀浆上清液中的tgf-β1、fgf-9的含量及活性。
2.试验结果
2.1小鼠一般生理状态及体重变化
各组小鼠在适应性喂养阶段均表现活泼，活动力好，反应灵敏，食欲好，皮毛光滑发亮。模型小鼠在造模后1-7天内体重较造模前明显下降，精神萎靡，活动力差，反应迟钝，皮毛亦杂乱无章，有不同程度气促。随时间推移，造模动物在8-14天体重保持稳定且逐渐增加但仍然轻于造模前。随着jxd干预治疗后，低、中、高剂量组动物体重较模型组体重增加多，活动、反应能力、皮毛色泽较均好于模型对照组；吡非尼酮组动物体重、活动、反应能力、皮毛光泽均好于模型对照组(见表1)。
表1jxd对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠体重的影响
组间比较采用单因素方差分析(onewayanalysisofvariance)，p<0.05差异有统计学意义，与空白组比较，##p＜0.01，空白组比较；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01。
2.2肺呼吸功能和肺顺应性变化
如表2所示，与空白对照组比较，模型对照组动物的呼气气道阻力(ri)显著增大(p<0.01)，呼出肺功量(fvc)、0.1秒内呼出量(fev0.1)、fev0.1/fvc、肺动态顺应性(cdyn)显著减小(p<0.05，p<0.01)，提示经博来霉素造模后，模型组小鼠肺功能减弱，表明造模成功；与模型组比较，jxd低、中、高剂量组fev0.1、fev0.1/fvc、cdyn显著上升(p<0.05，p<0.01)，jxd高剂量组fvc显著上升(p<0.01)，低、中剂量组fvc也呈上升趋势，但无显著性差异；与吡非尼酮组相比，jxd中、高剂量组fev0.1、fev0.1/fvc、cdyn、fvc显著上升(p<0.05，p<0.01)，提示jxd能够提高博来霉素造模后小鼠肺功能、且较吡非尼酮有明显的优势；与模型组比较，吡非尼酮组fev0.1、fev0.1/fvc显著上升(p<0.05，p<0.01)，fcv也呈上升趋势，但无显著性差异。
表2jxd对肺纤维化小鼠肺功能的影响
组间比较采用单因素方差分析(onewayanalysisofvariance)，p<0.05差异有统计学意义，与空白组比较，##p＜0.01，空白组比较；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01；与吡非尼酮组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01。
2.3病理组织学观察
2.3.1大体肺组织标本观察
各组小鼠在给药结束后次日麻醉、放血安乐死，空白组小鼠的肺脏外观正常，颜色红润，无苍白点，有光泽，表面光滑没有结节，质地柔软，有弹性；模型对照组小鼠肺脏颜色趋于苍白，光泽度较组差，质地空白对照组肺脏的硬度增加，肺脏表面凹凸不平，不光滑，弹性明显下降。经该化合物干预治疗的各组小鼠，其肺脏外观、质地、光泽度等介于模型对照组和空白对照组之间。给予吡非尼酮干预治疗的小鼠，其肺脏外观、质地、光泽度等好于模型对照组，与给药中剂量组程度相当。
2.3.2光镜下肺组织切片观察
2.3.2.1肺泡炎症观察(图1)
空白对照组小鼠肺组织结构未见明显异常(图1a)；模型对照组小鼠肺泡间隔明显增宽，肺泡融合塌陷、结构紊乱，可见大量炎性细胞与红细胞(图1b)；低剂量jxd组小鼠肺泡间隔增宽明显，肺泡间有大量炎性细胞与红细胞，肺泡结构不完整(图1c)；中剂量jxd组小鼠肺泡间隔增宽程度明显改善，有少量炎性细胞与红细胞，肺泡结构完整(图1d)；高剂量jxd组小鼠肺泡未见明显增厚，肺泡间仅有极少量的炎症细胞与红细胞，肺泡结构完成(图1e)；阳性药对照组小鼠肺泡间隔增宽明显，肺泡间有大量炎性细胞与红细胞，肺泡结构不完整(图1f)。如表1所示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺泡炎积分明显升高(p<0.01)；与模型对照组比较，jxd中、高剂量组小鼠肺泡炎积分明显下降(p<0.01)。提示jxd可以显著缓解博来霉素致小鼠肺泡的病理改变。
2.3.2.2肺组织纤维化观察(图2)
空白对照组小鼠肺组织可见少量绿色，属于正常染色反应(图2a)；模型对照组小鼠肺组织中可见大量绿色，绿色部位为胶原纤维(图2b)；低剂量jxd组小鼠肺组织绿色有大量绿色染色反应，但少于模型对照组(图2c)；中剂量jxd与阳性药对照组小鼠肺组织中可见部分绿色(图2d、g)；高剂量jxd组小鼠肺组织绿色较模型组明显减少(图2e)。如表3所示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺组织纤维化积分明显升高(p<0.01)；与模型对照组比较，jxd低、中、高剂量组小鼠肺组织纤维化积分明显下降(p<0.01，p<0.05)；与吡非尼酮组比较，jxd高剂量组小鼠肺组织纤维化积分明显下降(p<0.05)。提示jxd可以显著降低博来霉素致小鼠肺组织纤维化的程度。
表3jxd对小鼠肺组织病理积分的影响
组间比较采用单因素方差分析(onewayanalysisofvariance)，p<0.05差异有统计学意义，与空白组比较，##p＜0.01，空白组比较；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01；与吡非尼酮组比较，▲p＜0.05,▲▲p＜0.01。
2.4肺纤维化相关因子活性剂含量变化
如表4所示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺脏中tgf-β1、fgf9含量显著增加(p<0.01)，adpn(脂联素)的活性物含量无显著性差异；与模型对照组比较，jxd低、中、高剂量组小鼠肺组织中tgf-β1、fgf9含量显著减少(p<0.01)，中、高剂量组adpn(脂联素)活性含量显著增加(p<0.01)；与吡非尼酮组比较，jxd中、高剂量组小鼠肺组织中tgf-β1、fgf9含量显著减少(p<0.01)。与模型对照组比较，吡非尼酮组小鼠肺组织中tgf-β1、fgf9含量显著减少(p<0.01)adpn呈上升趋势，但无显著性差异。提示jxd能够下调肺纤维化小鼠肺脏中小鼠肺脏中tgf-β1、fgf9的含量。
表4jxd对肺纤维化小鼠肺脏中相关指标的影响
组间比较采用单因素方差分析(onewayanalysisofvariance)，p<0.05差异有统计学意义，与空白组比较，##p＜0.01，空白组比较；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01；与吡非尼酮组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。